2. 华南理工大学 材料科学与工程学院，广州 510641
2. School of Materials Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China
近年来，电活性聚合物因其能够快速响应机械刺激从而为细胞提供电刺激，有利于细胞增殖和分化而受到研究者的广泛关注[1-2]。聚偏氟乙烯(PVDF)具有良好的压电性、生物相容性及机械性能，逐渐成为最适合生物医用的压电高分子材料之一[3-5]，其主要应用于组织工程支架、神经导管及生物传感器等方面。但是，PVDF膜因其分子结构中含有大量氟原子而使其表面亲水性很差，细胞很难在其表面粘附分化，不易与组织形成生物性结合，这些问题限制了其生物应用和发展[6]。因此，如何改善PVDF膜的亲水性和生物活性受到广泛关注。
等离子体表面处理技术是目前表面改性PVDF膜的最常用方法之一[7]。等离子体表面处理可以在材料表面引入特定官能团或高分子链结构[8]。目前国内外大量关于不同气体等离子体对材料表面细胞亲和性影响的研究工作表明，含氮等离子体处理能在材料表面引入氨基，促进细胞的粘附和生长，且表面氨基的数量和密度对细胞粘附有重要影响[9-10]。但简单的等离子体表面处理只能在短时间内赋予材料一定的细胞相容性，不具有时效性。
聚偏氟乙烯作为生物医用材料更多是利用其电学特性[11-12]。但目前对聚偏氟乙烯膜表面改性的方法均忽略了对电学性能的影响。研究发现电学信号能促进细胞的增殖与分化，与骨组织的修复、重建密切相关[1]。有学者利用冲击波电学信号刺激了细胞成骨分化，促进骨生长和修复的临床效果[13]。聚吡咯(PPy)是一种广泛应用于生物领域的导电高分子材料[14-15]，这是因为聚吡咯良好的电学特性及生物相容性[16-17]。文中利用电化学法聚合纳米结构聚吡咯涂层表面改性聚偏氟乙烯膜，研究了纳米结构聚吡咯涂层对聚偏氟乙烯膜的亲水性、电学特性及生物相容性的影响。
1 试 验 1.1 聚偏氟乙烯膜样品制备将一定量PVDF粉末 (FR904，内蒙古三爱富万豪氟化工有限公司)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和丙酮(4∶6)的混合液中，在60 ℃下搅拌4 h至完全溶解。将上述PVDF溶解液通过溶液涂覆法在清洗处理后的载玻片表面制备PVDF膜。
根据前期研究成果[18-19]，利用电化学工作站(ZENNIUM)分别通过恒压法(反应电压为0.8 V，反应时间为30 s)和恒流法(反应电流密度为0.9 mA/cm2，反应时间为7 min)以pH 7.4的PBS溶液中加入0.1 M吡咯单体和0.01 M萘磺酸掺杂剂为电解液在喷金后的PVDF膜表面电沉积聚吡咯纳米颗粒和纳米线结构的涂层，分别命名为PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires。
1.2 结构表征利用场发射扫描电镜(Nano-430，SEM)和原子力显微镜(SPM-9600)分析各种样品的表面形貌；通过Bruker 光谱仪，利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱以 1 cm−1的分辨率对样品在600~4000 cm−1范围内检测；原子力显微镜(SPM-9600)开尔文扫描模式用于分析样品表面电势分布。采用表面接触角测量仪(INCA X-act)分析样品表面接触角(SCA)大小及亲水性，表面测定时间10 s，去离子水滴液滴1.0 μL。样品重复数为3，每个样品重复测量4次，求平均值和标准偏差。
1.3 生物活性评价 1.3.1 体外矿化采用仿生矿化的方法对PVDF膜、PVDF-PPy Nanopaticles膜和PVDF-PPy Nanowires膜样品的体外生物活性进行评价。37 ℃恒温下，15 mL 离心管中加入10 mL模拟体液(Simulated body fluid，SBF)并将样品垂直浸泡3 d，隔天换一次液。SBF溶液按照Kukobo配方(表1)配制，酸洗所有容器，在烧杯中加入700 mL去离子水，缓慢依次按表1顺序加入药品并搅拌至完全溶解，定容到1000 mL，逐滴加入Tris和盐酸调节pH至7.4，摇匀。样品浸泡矿化3 d后，取出并用去离子水清洗3次，干燥待用。
| Order | Reagents | Weights |
| 1 | NaCl | 11.994 g |
| 2 | NaHCO3 | 0.525 g |
| 3 | KCl | 0.336 g |
| 4 | K2HPO4·3H2O | 0.342 g |
| 5 | MgCl2·6H2O | 0.458 g |
| 6 | 1M HCl | 60 mL |
| 7 | CaCl2 | 0.417 g |
| 8 | Na2SO4 | 0.107 g |
| 9 | Tris | 9.086 g |
采用三至五代骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)进行细胞试验，在37 ℃，5%CO2条件下使用含有10%胎牛血清蛋白(Fetal bovine serum protein，FBS)和1%的双抗低糖细胞培养基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培养细胞。待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞并用培养基重悬为细胞悬液，以2×104 cells/mL浓度接种在分别通过75%酒精，无菌PBS，紫外光照射灭菌后的膜样品表面。每隔一天换一次液。
1.3.3 骨髓间充质干细胞死活染色膜样品表面BMSCs培养24 h后，弃除培养基废液，利用无菌PBS缓冲液轻轻清洗2~3次；按每孔300 μL死活染色液计算所需染色液体积，并采用1 mg/mL的钙黄绿素及1 mg/mL的碘化丙锭储存液加入无菌PBS缓冲液中稀释配制好死活染色液，避光放入培养箱中孵育30 min；取出材料，PBS溶液清洗3次。通过荧光显微镜在相同位置对活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)进行观察拍照记录。
1.3.4 细胞增殖试验通过CCK-8试剂盒对膜样品表面培养1、3和5 d后的BMSCs细胞增殖情况进行定量分析。细胞培养1、3、5 d后，分别弃除孔板中的培养基废液；按每孔300 μL体积计算试验所需CCK-8溶液体积，并以CCK-8试剂与培养基体积比为1/10配制CCK-8溶液。加入孔板样品中并在培养箱中避光孵育2~4 h，取出混匀CCK-8检测液，吸取200 μL混合液至96孔板中，并通过酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。
1.3.5 统计分析试验重复次数至少为3次，样品重复数为4，数据以平均值±标准方差表示，使用GraphPad Prism软件进行统计学分析，p<0.05时为统计学差异，p<0.01为显著性差异。
2 结果与讨论 2.1 改性前后聚偏氟乙烯膜表面形貌与结构通过电化学法聚合导电PPy涂层改性前后PVDF膜表面形貌如图1所示。未改性PVDF膜表面主要是球状结构，且呈现均匀连续分布区域，这是由于膜在制备过程中富集聚合物相聚合在一起，而溶剂相蒸发而形成的结构。PPy涂层改性PVDF膜表面形貌主要是PPy纳米结构沉积在PVDF球上，不同电化学条件构建的PPy涂层改性PVDF膜表面形貌不同，分别是PVDF球状结构上沉积了大量PPy纳米颗粒和PPy纳米线，使整个样品表面是微米结构中有纳米表面。大量研究表明，这种微米结构中有纳米表面有利于细胞粘附和增殖，促进组织生长，改善材料与组织的结合[20]。
|
| 图 1 PVDF膜和不同电化学条件下PPy涂层改性PVDF膜的SEM形貌 Fig. 1 SEM images of PVDF membrane and PVDF membrane modified by PPy coating under different parameters |
图2为PVDF膜及纳米结构PPy涂层改性PVDF膜样品的红外谱图及纳米结构PPy涂层改性PVDF膜样品的ESD能谱分析。从图中可以看出，PVDF膜、PVDF-PPy nanopaticles膜和PVDF-PPy nanowires膜3组样品在1402 cm−1，1172 cm−1和873 cm−1处都显示C−F特征吸收峰[17,21]。且通过对比分析PVDF膜的谱图发现，PVDF-PPy nanopaticles膜和PVDF-PPy Nanowires膜的红外谱图在1538 cm−1和1289 cm−1处有Py环中C−N和C=C的振动特征峰，及C−H的面内振动峰在谱图中668 cm−1和965 cm−1处也有出现[22]。这表明聚吡咯涂层已成功电聚合改性在PVDF膜表面。同时PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires膜样品的ESD能谱分析结果均含有聚吡咯特有的N、O元素，这也证实了聚吡咯涂层成功电聚合在PVDF膜表面的结论。且因聚吡咯纳米颗粒没有完全覆盖满在PVDF膜表面，而聚吡咯纳米线完全覆盖在PVDF膜表面，表面能谱显示出PVDF-PPy nanopaticles样品的N、O元素含量低于PVDF-PPy nanowires膜样品，而F元素含量则高于后者。
|
| 图 2 PVDF、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜的红外谱图及EDS能谱分析 Fig. 2 Infrared spectra and EDS results of PVDF, PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires films |
进一步利用AFM接触模式表征了聚偏氟乙烯膜改性前后的形貌。如图3所示，未改性PVDF膜表面的微球颗粒十分明显，但受AFM测试探针检测所限，PVDF-PPy nanopaticles膜和PVDF-PPy nanowires膜的形貌需要在较高倍数下观察更明显。从图3(b)(c)中，也可以发现PPy纳米颗粒和纳米线是在PVDF膜表面的微球上分布沉积，这也与电镜形貌结果一致。3种膜样品的表面接触角(SCA)结果如图3中插图所示，未改性PVDF膜表面接触角为108°，比较疏水，而PVDF-PPy nanopaticles膜表面接触角为76°，PVDF-PPy nanowires膜表面接触角为43°，比未改性PVDF膜更加亲水。这说明纳米结构PPy涂层改性提高了PVDF膜表面的亲水性。这是因为PPy分子结构中含有C-N键，且掺杂剂中含有亲水基团磺酸基。另一方面，纳米结构PPy涂层改性的PVDF膜表面的微米结构中有纳米表面显著提高了膜表面比表面积，这也将提高膜表面的亲水性[23]。
|
| 图 3 PVDF、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜的AFM形貌和表面接触角 Fig. 3 AFM morphologies and surface contact angles of PVDF, PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires films |
通过原子力显微镜的开尔文扫描模式 (KFM)测试了未改性PVDF膜，PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜样品的表面电学性能。测试过程中样品受交流偏压作用，产生表面电荷并累积，累积电荷在探针尖端和样品之间产生静电力，会导致相图发生位移。图4(a~c)分别是未改性PVDF膜，PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜样品的表面电势分布图，表面电势Vzjis(绝对值)结果分别对应如下：PVDF膜为0.43 V；PVDF-PPy nanopaticles膜为0.98 V；PVDF-PPy nanowires膜为1.50 V。表面电势由聚吡咯的掺杂剂磺酸基团所贡献，PVDF-PPy nanowires膜涂层完全覆盖在PVDF膜表面，掺杂剂含量高，故表面电势提高较大。可以发现，纳米结构PPy涂层的存在显著提高了PVDF膜的表面电势，丰富了PVDF膜表面亲水性带负电功能基团，这将有利于促进细胞的粘附与增殖[24]。
|
| 图 4 PVDF、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜的表面电势分布图 Fig. 4 Surface potential profile of PVDF, PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires films |
为检测纳米结构聚吡咯表面改性前后聚偏氟乙烯膜的体外矿化性能，将所有膜样品在模拟体液中浸泡矿化3天后，取出样品，用去离子水缓慢清洗干净，真空干燥箱中37 ℃干燥，并用扫描电镜观察样品表面矿化层形貌并利用表面能谱测试分析表面矿化物的成分。
如图5所示，矿化结果表明未改性PVDF膜样品表面矿化层主要是由钙、磷元素组成的类骨矿物，且Ca/P为1.33的类骨矿物比较少，分布不均，这是由于其表面比较疏水导致矿物沉积能力较差。而纳米结构PPy涂层改性的PVDF膜因明显改善了表面亲水性，因此PVDF-PPy nanopaticles膜和PVDF-PPy nanowires膜表面沉积物较多，且PVDF-PPy nanowires膜表面大量沉积物完全均匀分布在样品表面，显示出更好的类骨矿物沉积能力。
|
| 图 5 PVDF、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜体外矿化3天后的表面沉积物形貌 Fig. 5 Surface topographies of PVDF, PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires films after 3 days of mineralization |
结合表面接触角结果分析表明PVDF-PPy nanowires膜亲水性更强，且根据KFM结果可以发现PVDF-PPy nanowires膜表面的电势分布高于PVDF-PPy nanopaticles膜表面，说明PVDF-PPy nanowires膜表面类骨矿物沉积能力较强。因此，表明纳米结构PPy涂层改性PVDF膜因提高表面亲水性和表面电势分布更有利于类骨矿物沉积。
2.4 改性前后聚偏氟乙烯膜的生物相容性采用Live/Dead荧光染色试剂对未改性PVDF膜、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires3种膜样品表面培养了24 h的BMSCs进行荧光染色，探究纳米结构PPy涂层改性前后PVDF膜的细胞毒性。细胞死活染色结果如图6所示，由图中可以看出3种膜样品表面均能观察到绿色荧光标记的活细胞。说明BMSCs均能在3种表面存活，且BMSCs在膜样品表面附着良好。对比图6(a)可以发现，统计学分析结果表明PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires改性膜样品表面细胞活细胞粘附数量明显高于未改性PVDF膜，且PVDF-PPy nanowires表面活细胞数量最多。这一结果进一步证实了表明纳米结构PPy涂层改性PVDF膜因提高表面亲水性和表面电势分布更有利于表面细胞的粘附。
|
| 图 6 PVDF、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires膜表面BMSCs培养24 h后的死活染色荧光图和定量统计分析结果 Fig. 6 Live/Dead staining fluorescent images and quantitative statistical analysis results of of BMSCs cultured for 24 h on the surface of PVDF, PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires films |
骨髓间充质干细胞接种到未改性PVDF膜、PVDF-PPy nanopaticles和PVDF-PPy nanowires3种膜样品表面培养1、3和5 d后利用CCK-8试剂盒定量检测样品表面细胞增殖行为，分析纳米结构聚吡咯涂层改性对PVDF膜表面细胞增殖的影响。试验结果如图7所示，与未改性PVDF膜样品相比，纳米结构PPy表面改性得到的PVDF-PPy nanopaticles膜和PVDF-PPy nanowires膜样品表面的细胞测定吸光度值均有所增加，且PVDF-PPy nanowires膜样品组增殖效果较为明显。结合细胞死活染色结果，表明纳米结构PPy涂层表面改性PVDF膜明显提高了其生物相容性。
|
| 图 7 骨髓间充质干细胞在膜样品表面培养1、3和5 d的CCK-8检测细胞增殖结果 Fig. 7 Proliferation results of BMSCs cultured on the surface of PVDF, PVDF-PPy nanopaticles and PVDF-PPy nanowires films for 1, 3 and 5 days tested by CCK-8 (*p <0.05, **p <0.01) |
通过电化学法聚合导电聚吡咯涂层改性聚偏氟乙烯膜，结果表明：
(1)聚吡咯涂层均匀分布在聚偏氟乙烯膜微球表面，且恒压法改性得到PVDF-PPy nanopaticles膜层，恒流法改性得到PVDF-PPy nanowires膜层。
(2) 聚吡咯涂层明显改善了聚偏氟乙烯膜表面亲水性和表面电势分布，且PVDF-PPy Nanowires改性膜表面亲水性和表面电势分布显著提高。
(3) 聚吡咯涂层明显改善了聚偏氟乙烯膜表面生物活性，提高了表面矿物沉积能力和细胞生物相容性。
| [1] | NING C, ZHOU Z, TAN G, et al. Electroactive polymers for tissue regeneration: Developments and perspectives[J]. Progress in Polymer Science, 2018, 81: 144-162. |
| 点击浏览原文 | |
| [2] | NUNES-PEREIRA J, RIBEIRO S, RIBEIRO C, et al. Poly(vinylidene fluoride) and copolymers as porous membranes for tissue engineering applications[J]. Polymer testing, 2015, 44: 234-241. |
| 点击浏览原文 | |
| [3] | RIBEIRO C, CORREIA D M, RIBEIRO S, et al. Piezoelectric poly(vinylidene fluoride) microstructure and poling state in active tissue engineering[J]. Engineering in Life Sciences, 2015, 15(4): 351-356. |
| 点击浏览原文 | |
| [4] | RAJABI A H, JAFFE M, ARINZEH T L. Piezoelectric materials for tissue regeneration: A review[J]. Acta Biomaterlalia, 2015, 24: 12-23. |
| 点击浏览原文 | |
| [5] | CORREIA D M, GON ALVES R, RIBEIRO C, et al. Electrosprayed poly(vinylidene fluoride) microparticles for tissue engineering applications[J]. RSC Advances, 2014, 4(62): 33013. |
| 点击浏览原文 | |
| [6] | DAMARAJU S M, WU S, JAFFE M, et al. Structural changes in PVDF fibers due to electrospinning and its effect on biological function[J]. Biomedical Materials, 2013, 8(4): 045007. |
| 点击浏览原文 | |
| [7] | KAMAZ M, SENGUPTA A, GUTIERREZ A, et al. Surface modification of PVDF membranes for treating produced waters by direct contact membrane distillation[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2019, 16(5): doi. 10.3390/ijerph16050685. |
| [8] | GUO D, HAN Y, HUANG J, et al. Hydrophilic poly(vinylidene fluoride) film with enhanced inner channels for both water- and ionic liquid-driven ion-exchange polymer metal composite actuators[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2019, 11(2): 2386-2397. |
| 点击浏览原文 | |
| [9] | SAHRASH R, SIDDIQA A, RAZZAQ H, et al. PVDF based ionogels: applications towards electrochemical devices and membrane separation processes[J]. Heliyon, 2018, 4(11): e00847. |
| 点击浏览原文 | |
| [10] | DING S, ZHANG L, LI Y, et al. Fabrication of a novel polyvinylidene fluoride membrane via binding SiO2 nanoparticles and a copper ferrocyanide layer onto a membrane surface for selective removal of cesium[J]. Journal of Hazardous Materials, 2019, 368: 292-299. |
| 点击浏览原文 | |
| [11] | ZHANG Z, YAO C, YU Y, et al. Mesoporous piezoelectric polymer composite films with tunable mechanical modulus for harvesting energy from liquid pressure fluctuation[J]. Advanced Functional Materials, 2016, 26(37): 6760-6765. |
| 点击浏览原文 | |
| [12] | MARINO A, GENCHI G G, MATTOLI V, et al. Piezoelectric nanotransducers: The future of neural stimulation[J]. Nano Today, 2017, 14: 9-12. |
| 点击浏览原文 | |
| [13] | HAFFNER N, SMOLEN D, DAHM F, et al. Significance of extracorporeal shockwave therapy in fracture treatment[J]. Translational Research in Biomedicine, 2017(6): 42-63. |
| [14] | SPEARMAN B S, HODGE A J, PORTER J L, et al. Conductive interpenetrating networks of polypyrrole and polycaprolactone encourage electrophysiological development of cardiac cells[J]. Acta Biomaterialia, 2015, 28: 109-120. |
| 点击浏览原文 | |
| [15] | YANG M, LIANG Y, GUI Q, et al. Electroactive biocompatible materials for nerve cell stimulation[J]. Materials Research Express, 2015, 2(4): 042001. |
| 点击浏览原文 | |
| [16] | STOPPEL W L, KAPLAN D L, BLACK L D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2016, 96: 135-155. |
| 点击浏览原文 | |
| [17] | YAN L, ZHAO B, LIU X, et al. Aligned nanofibers from polypyrrole/graphene as electrodes for regeneration of optic nerve via electrical stimulation[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2016, 8(11): 6834-6840. |
| 点击浏览原文 | |
| [18] | ZHOU Z, LI W, HE T, et al. Controllable protein adsorption and bacterial adhesion on polypyrrole nanocone arrays[J]. Journal of Materials Science & Technology, 2016, 32(9): 950-955. |
| 点击浏览原文 | |
| [19] | ZHOU Z, ZHU W, LIAO J, et al. Chondroitin sulphate-guided construction of polypyrrole nanoarchitectures[J]. Materials Science and Engineering: C, 2015, 48: 172-178. |
| 点击浏览原文 | |
| [20] | WEI Y, MO X, ZHANG P, et al. Directing stem cell differentiation via electrochemical reversible switching between nanotubes and nanotips of polypyrrole array[J]. ACS Nano, 2017, 11(6): 5915-5924. |
| 点击浏览原文 | |
| [21] | HITSCHERICH P, WU S, GORDAN R, et al. The effect of PVDF-TrFE scaffolds on stem cell derived cardiovascular cells[J]. Biotechnol Bioeng, 2016, 113(7): 1577-1585. |
| 点击浏览原文 | |
| [22] | HUANG Z B, YIN G F, LIAO X M, et al. Conducting polypyrrole in tissue engineering applications[J]. Frontiers of Materials Science, 2014, 8(1): 39-45. |
| 点击浏览原文 | |
| [23] | ROBERTS J N, SAHOO J K, MCNAMARA L E, et al. Dynamic surfaces for the study of mesenchymal stem cell growth through adhesion regulation[J]. ACS Nano, 2016, 10(7): 6667-6679. |
| 点击浏览原文 | |
| [24] | YU P, NING C, ZHANG Y, et al. Bone-inspired spatially specific piezoelectricity induces bone regeneration[J]. Theranostics, 2017, 7(13): 3387-3397. |
| 点击浏览原文 |