聚四氟乙烯(PTFE)具有良好的生物稳定性或生物惰性，不会引起机体的排斥[1-3]，是目前人工血管以及隆鼻假体所使用主要材料之一[4-5]。然而，其极低的表面能使得表面具有很强的疏水特性，这使得其难以促进细胞附着与后续的增殖分化等，进而直接影响了其在生物体内与组织的结合[6]。然而，常用的改进PTFE表面亲水特性的方法，如离子束注入[7-9]、钠-萘络合物处理[10-13]、等离子体处理[14-16]和高温熔融[17]等，尽管能够活化其表面并提高亲水性，但是有些方法操作复杂且有毒成份残留影响细胞响应，有些会造成PTFE基体的损伤，还有些方法表面亲水特性会随时间延长而逐渐消失。因此，研究简单高效的、对基板损伤小并可提高表面细胞响应性的PTFE表面改性方法对其生物医用研究具有重要的意义。
作为表面生物医用涂层或薄膜应用时，相当多的研究发现TiO2是一种表面亲水性较好且具有优良细胞响应性的材料[18-20]。Liu等[21]通过研究发现相比于Ti基板，TiO2涂层包覆的Ti基板更能促进成骨细胞粘附和增殖。因此，如在PTFE表面形成一层TiO2薄膜有可能有效提高其细胞响应性。然而，由于PTFE基板表面能极低，在其表面直接制备TiO2薄膜有一定的困难。近年来的研究发现，源于贻贝黏附蛋白中的一种黏附功能单元——多巴胺，能够自聚成膜并具有良好的粘附性，几乎可以黏附在所有材料表面[22-23]，且具有良好的生物相容性[24]。因此，利用聚多巴胺(PDA)能够将其作为“粘结剂”实现多种材料表面的改性以及涂层或薄膜的制备。Lee等[22]发现将PTFE浸泡于多巴胺缓冲液中一段时间，其表面即出现一层PDA薄膜。利用这一特点，在PDA形成过程中引入TiO2有可能在PTFE表面形成复合薄膜。
鉴于此，研究通过将多巴胺缓冲液与TiO2水溶胶混合，采用聚多巴胺化学及原位共沉积法在PTFE基板表面沉积得到PDA/TiO2复合薄膜，并对其与基板的结合力以及亲水性和细胞响应性等进行了评估。
1 试 验 1.1 薄膜制备按体积比1∶1∶1将丙酮、无水乙醇和去离子水的制备成混合溶液，将1 cm×1 cm的聚四氟乙烯(PTFE，诺伊费德有限公司)基板放入混合溶液中超声清洗30 min后，置于60 ℃烘箱干燥，再采用等离子体(空气等离子体)对PTFE基板活化30 min。将0.0607 g的TRIS和0.10 g盐酸多巴胺(阿拉丁化学试剂有限公司)依次加入到50 mL去离子水中，磁力搅拌至完全溶解，调节pH = 8.5得到多巴胺-TRIS缓冲液。然后，将TiO2水溶胶(湖南钛唐纳米科技有限公司，20%，质量分数)与去离子水按体积比1∶5混合，超声震荡1 h得到稀释后的TiO2水溶胶。在磁力搅拌下将一定量的TiO2水溶胶加入多巴胺-TRIS缓冲液中，混合均匀。将经等离子体处理后的PTFE基板分别浸入不同TiO2含量水溶胶的混合溶液以及多巴胺-TRIS缓冲液中24 h，浸泡完毕后将其取出置于防潮柜中2 h，即可得到所需的PDA/TiO2复合薄膜及PDA薄膜参比样。
1.2 薄膜表征采用扫描电子显微镜(SEM)观察复合薄膜表面形貌，并使用原子力显微镜(AFM)表征其表面粗糙程度。采用能谱分析仪(EDS)表征复合薄膜中所含元素。基板表面的亲水性使用接触角测量仪(OCA20)表征。紫外照射后的接触角利用365 nm紫外灯照射20 min后测量。复合薄膜与基板的结合牢固程度通过用去离子水冲刷的方法来表征。其具体结合力大小通过剪切强度来表征：将3 M胶带粘结在薄膜表面，利用力学试验机水平撕扯胶带测得薄膜与基板的剪切强度[25]。
1.3 生物学评价利用复合薄膜表面细胞的黏附与增殖情况来评价其生物相容性。所用的细胞为小鼠前成骨细胞 (MC3T3-E1) 和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)。细胞的培养条件如下：将细胞株置于37 ℃，5% CO2体积分数以及湿度饱和的细胞培养箱内。使用CCK-8试剂盒测试细胞粘附和增殖性能。具体检测方法如下[26]：培养细胞一定时间后，将样品取出置于新的24孔板中，并向每个孔中分别加入500 μL细胞培养基以及50 μL CCK-8溶液，将其置于细胞培养箱中反应3 h；然后将反应后的培养基吸入到全新96孔板中，每孔容量为120 μL，利用酶标仪在测定其在450 nm处的吸光度(OD值)。
为表征细胞在材料表面的黏附与铺展情况，在材料表面接种密度为1×105 cells/cm2的细胞后，置于细胞培养箱中培养24 h，取出后先用4%多聚甲醛固定15 min，固定完毕后加入0.4%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)进行处理，处理时间为15 min，然后使用鬼笔环肽对细胞的骨架进行染色，染色时间为30 min，使用DAPI染料对细胞核染色5 min，染色完成后使用荧光显微镜对细胞的形态进行观察。
2 结果与讨论 2.1 薄膜的形貌与组成通过原位共沉积法制得的薄膜如图1所示。从图1(a)中可见，初始的聚四氟乙烯基板表面较粗糙。通过AFM表征显示其粗糙度为(41.4±3.2) nm；进行等离子体处理后，其表面粗糙程度明显增大(图1(b))，增至(86.0±4.0) nm。粗糙度的提高显示等离子体处理去除了部分表面，这有利于暴露新鲜表面并形成悬挂键，从而提高表面能并促进后续的反应。浸泡形成PDA后(图1(c))，基板表面变得更加平整光滑，其粗糙度也降至(31.6±1.1) nm。当PDA与TiO2纳米颗粒共沉积后(图1(d))，表面形成一层纳米颗粒致密堆积的均匀薄膜。这使得表面粗糙度略有增至(34.3±1.5) nm。图2(a)中的XRD测试结果显示，在25.35°、37.83°、48.12°、53.92°、55.11°和62.71°等处的衍射峰，与锐钛矿相二氧化钛的特征衍射峰峰位吻合良好。这显示PDA/TiO2复合薄膜中有锐钛矿相TiO2存在。
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| 图 1 基板及薄膜表面形貌及粗糙度 Fig. 1 Morphologies and roughness of the substrate and films |
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| 图 2 PDA/TiO2复合薄膜的晶相及润湿特性 Fig. 2 Crystalline phase and wettability of polydopamine/TiO2 composite films |
水接触角结果显示PTFE基板表面处于疏水状态，水接触角约为118°左右。而如图2(b)所示，PDA/TiO2复合薄膜表面亲水性随着浸泡溶液中TiO2水溶胶的体积的增加而显著下降。不仅如此，经365 nm紫外光照射后，PDA/TiO2复合薄膜的水接触角显著降低，且降低幅度与薄膜沉积混合液中TiO2水溶胶含量的增多成正比。考虑到TiO2在紫外光照射下具有显著的光致亲水特性，表面亲水性在紫外光照后的变化主要来自于薄膜中的TiO2，紫外光照后水接触角下降幅度的增加意味着复合薄膜中的TiO2含量显著增加。表1中PDA/TiO2复合薄膜的化学成分分析进一步证实了这一点。如表1所示，基板表面主要有C、F两种元素，经过等离子体处理后基板的元素组成变化不大。当表面沉积PDA/TiO2复合薄膜后薄膜中Ti的存在显示表面的颗粒为TiO2纳米颗粒。且随着TiO2加入量的增加，所检测到的复合薄膜中Ti元素含量也随之增加。
| Samples | Atomic percentage, a/% | |||
| C | F | Ti | O | |
| PTFE substrate | 26.88 | 72.74 | 0.00 | 0.37 |
| PTFE substrates after plasma | 27.70 | 71.87 | 0.00 | 0.43 |
| PDA films | 28.84 | 70.22 | 0.00 | 0.94 |
| PDA/TiO2 composite films (1 mL) | 28.14 | 71.23 | 0.05 | 0.59 |
| PDA/TiO2 composite films (3 mL) | 27.42 | 71.77 | 0.08 | 0.73 |
| PDA/TiO2 composite films (5 mL) | 26.84 | 72.22 | 0.09 | 0.85 |
| PDA/TiO2 composite films (7 mL) | 25.78 | 72.96 | 0.12 | 1.14 |
这些结果显示，所得的到复合薄膜表面亲水性得到了改善，且复合薄膜中的TiO2含量可以通过混合溶液中TiO2水溶胶的加入量来调控，进而调控薄膜表面的亲水特性。如前所述，由于PTFE的疏水特性是影响其表面细胞响应性的重要因素，这种可调的亲水特性可能有利于增强细胞粘附。而且，其表面亲水特性可能通过简单的紫外光照进行调控，这在其表面亲水特性减弱，如在长期存放之后的再亲水化是十分有益的。
2.2 薄膜的结合强度薄膜是否能够稳定存在于PTFE表面是影响其性能稳定性的关键。针对这一特性，首先进行了去离子水冲洗法测试。从冲洗前(图3(a))和冲洗后(图3(b))的SEM形貌可以看出，PDA/TiO2复合薄膜基本保持了完整连续，并无明显的脱落现象。这是由于多巴胺溶液很容易在基板上发生自聚合，所生成的PDA具有非常牢固的结合力，而且在沉积过程中TiO2纳米颗粒可以嵌入到PDA的分子链中，与其牢固结合，因此去离子水冲洗无法使TiO2颗粒从其表面脱附。这一结果意味着，复合薄膜在体内液体环境、以及体液的冲刷下具有较好的稳定性。进一步采用如图4(a)所示的剪切强度法对复合薄膜与PTFE基板的结合强度进行了表征。结果显示，复合薄膜与基板的剪切强度达到了23.5 MPa (图4(b))。而且，对剪切强度测试后的断裂表面的形貌分析表明，薄膜主体绝大多数较牢固结合于基板上，只有少量薄膜在剪切试验中从表面脱附，显示出混合断裂模式。这些结果证明薄膜与基体有着良好的结合强度。
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| 图 3 PDA/TiO2复合薄膜经去离子水冲前后SEM形貌 Fig. 3 SEM images of the PDA/TiO2 composite films before and after rinsing with distilled water |
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| 图 4 薄膜剪切强度及断口形貌 Fig. 4 Film bonding strength and SEM image of fracture after shear bond strength testing |
PDA/TiO2复合薄膜表面的细胞响应性对其进一步细胞响应极为重要，细胞在薄膜表面初期的附着及增殖性能常用来表征薄膜的细胞响应性性。图5的CCK-8结果显示，成纤维细胞和前成骨细胞均能在薄膜表面良好附着及增殖。当PTFE基板表面沉积PDA/TiO2复合薄膜后，其24 h细胞OD值与PTFE及PDA膜对照组相比均略有增加。由于CCK-8值与细胞数量相关，这一结果通常意味着细胞数量的增加；而24 h细胞数量通常用来衡量表面上细胞附着的行为。因此，这一结果意味着复合薄膜表面亲水性的增强促进了细胞的附着。经过72 h培养后，包括PTFE在内的所有基板表面的OD值均增高了，这一结果说明附着在表面上的细胞数量通过增殖而增加了。不仅如此，PDA/TiO2复合薄膜样品的OD值增加幅度显著高于对照的PTFE基板。这进一步显示，PDA/TiO2复合薄膜的表面进一步促进了细胞的增殖。而且，所采用的两种不同各类的细胞显示出类似的结果，这意味着该结果有一定的代表性。因此，在PTFE基板表面制备PDA/TiO2复合薄膜，可以有效地改进其表面包括细胞附着和细胞增殖在内的细胞响应性。
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| 图 5 细胞在基板与薄膜表面的黏附与增殖情况 Fig. 5 Cell viability and proliferation of the substrate and films (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) |
图6中的细胞形态研究进一步显示了PTFE基板表面PDA/TiO2复合薄膜对细胞响应性的作用。表面接种成纤维细胞1天后细胞在其表面的黏附与铺展情况显示，细胞在PTFE基板表面的铺展状态较差，伪足较为不明显，可观察到的数量十分有限，细胞大多呈蜷缩态(图6(a))；而在PDA/TiO2复合薄膜表面，细胞可以很好地在表面黏附和铺展，细胞呈无规则铺展形态，可以观察到更多伪足，如图6(b)所示。这可以归结为PTFE基板表面的疏水特性，不利于细胞黏附和铺展。进一步结合图5中细胞附着数量及增殖结果，可以看出，在PTFE基板表面制备PDA/TiO2复合薄膜可以有效地改进其表面的细胞响应特性。
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| 图 6 PTFE及PDA/TiO2表面细胞形态 Fig. 6 Cell morphologies on PTFE substrate and PDA/TiO2 film |
利用聚多巴胺化学通过原位共沉积法能够有效地在PTFE基板表面制备了PDA/TiO2复合薄膜，且复合薄膜中的TiO2含量可以通过调节薄膜沉积混合溶液中的TiO2水溶胶含量调控。薄膜与基板结合牢固，其剥离剪切力达到了23.5 MPa。同时，复合薄膜显示出良好的抗冲刷性能。复合薄膜表面具有较好的细胞相容性，NIH3T3和MC3T3-E1细胞在其表面的附着及增殖情况均优于未改性的PTFE基板。这些研究结果表明,在PTFE基板表面沉积PDA/TiO2复合薄膜能显著提高其表面的细胞响应性，从而改进其作为生物医用材料应用时与组织细胞相互作用的性能。
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