2. 天津大学 材料科学与工程学院,天津 300072
2. School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China
20世纪50年代以来,钛基合金因其良好的机械强度、耐腐蚀性和生物相容性,被广泛应用于骨科植入材料的硬组织修复或重建[1-3]。然而,术后却存在着细菌感染和骨组织缺乏整合的两大问题,这通常会导致植入体的失败,从而需要二次手术,增加病人痛苦[4-7]。
锌是人体必需的微量元素,在人体和细胞发育中发挥着重要作用[8-9]。近期研究报道,锌离子具有良好的抗菌性能[10-12]。考虑到细菌感染引起的局部酸化,氧化锌量子点(Zinc oxide quantum dots,ZnO QDs)对pH变化敏感,其在正常生理pH值下稳定,但溶于酸性环境,且溶解过程中释放的锌离子具有杀菌效果[13]。此外,ZnO QDs价格低廉,易于制备。这些优点使ZnO QDs成为制备pH响应系统,提高平台抗菌能力的理想可靠材料[14-16]。
天然和合成聚合物表面改性是一种常见的功能化和生物活化过程。与纤维连接蛋白等基质蛋白涂覆聚合物表面相比,小肽的应用显示出明显的优势,这些基质蛋白可以同时受到酶降解和免疫失活的影响[17]。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是一段3个氨基酸组成的短肽序列,是许多细胞表面某些整合素的特异性配体之一,可诱导细胞的附着。与其类似,RGD—半胱氨酸(Arginine-glycine-aspartic acid-cysteine,RGDC)亦能参与和激活细胞上的整合素粘附受体,有效地促进多种细胞对不同底物的粘附[18]。因此,RGDC肽的共价固定是一种改善细胞黏附和增殖、提高成骨性能的可行策略[19-20]。
因此,文中在钛植入体上设计了一种新颖的表面系统,ZnO QDs经RGDC修饰后,连接到表面包覆有PDA的钛植入体表面,形成的PDA(polydopamine)/RGDC(arginine-glycine-aspartic acid-cysteine)/氧化锌量子点(ZnO QDs)复合涂层不仅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的抗菌活性,而且具有良好的生物相容性和促细胞粘附性。
1 试验 1.1 样品制备将Φ 6 mm×2.5 mm的纯钛片用不同粒度61、23、18、10.8、5.4 μm (240、600、800、1200和2400目)的SiC砂纸依次打磨,随后用丙酮、乙醇和去离子水依次超声清洗9 min,最后用热空气干燥。配制4 mol/L的氢氧化钾(KOH,国药,纯度>99%)溶液,将经打磨抛光干燥后的钛片放入聚四氟乙烯内胆,缓慢倒入配置好的碱液至内胆的1/2处,盖好盖子放入反应釜,将反应釜放入80 ℃的炉子里恒温反应2 h,然后自然冷却至室温,取出反应釜,将内胆里的钛片取出,去离子水反复冲洗,室温干燥,处理完后的钛片标记为Ti-OH。配制2 mg/mL的多巴胺溶液,将上述处理的钛片放入多巴胺溶液中浸泡48 h,去离子水冲洗晾干备用,将多巴胺浸泡后的钛片标记为Ti-OH-PDA。
1.1.1 氧化锌量子点的制备将醋酸锌(440 mg, 2.0 mmol)和醋酸镁(44 mg, 0.2 mmol)在剧烈搅拌下溶于热乙醇(30 mL)中。在另一个烧瓶中,NaOH (100 mg, 2.5 mmol)溶于回流乙醇(10 mL)中。然后在冰浴中冷却溶液。接着将上述NaOH溶液快速注入含有醋酸锌和醋酸镁的烧瓶中。将混合物搅拌8 h进行粒子生长,得到的透明量子点色散在紫外灯激发下(365 nm)呈现绿色。最后用正己烷作为非溶剂沉淀ZnO QDs,用乙醇洗涤三次,真空烘箱干燥备用。
1.1.2 RGDC修饰的氧化锌量子点的制备将0.01 g RGDC粉末和0.1 g ZnO QDs加入到装有20 mL无水乙醇的小烧瓶中,冰水浴下搅拌24 h,离心分离得到ZnO@RGDC,真空烘箱干燥备用。
1.1.3 复合涂层的制备过程以乙醇为溶剂配备2 mg/mL的ZnO QDs溶液和ZnO@RGDC溶液,将经过多巴胺浸泡的钛片分别浸泡在配置好的上述溶液中12 h,而后取出用去离子水冲洗,低温干燥备用,所得样品分别标记为Ti-OH-PDA-ZnO和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC。
1.2 结构表征及生物学性能测试 1.2.1 表征手段采用配备有能谱仪(EDS)的扫描电子显微镜(SEM, JEOL-820和JSM6510LV)观察改性表面的形貌和组成。采用X射线衍射仪(XRD, Rigaku, D/Max-RB),X射线光电子能谱(XPS, Thermo Fisher Scientific 250Xi),傅里叶变换红外能谱(FTIR, NICOLEF 5700),透射电子显微镜(TEM, Tecnai G20, FEI, USA)测定ZnO QDs的微观结构。
1.2.2 抗菌试验以大肠杆菌(ATCC 25922,革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923,革兰氏阳性菌)为模型菌,为了测试样品的抗菌率,将不同样品(Ti-OH(对照组),Ti-OH-PDA,Ti-OH-PDA-ZnO,Ti–OH–PDA-ZnO @RGDC)放入48孔培养板,每孔加入300 μL稀释的细菌悬液(107 CFU/mL),然后将培养板放入37 ℃恒温培养箱(常压,5% CO2和95%空气)培养一段时间(金黄色葡萄球菌24 h,大肠杆菌12 h)后,取出样品,用酶标仪测试其在600 nm处的光密度,再转换成相应的抗菌效率,每个测试用3个平行样进行统计学分析。样品抗菌率(%)=(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100%
1.2.3 细胞毒性测试(MTT)MC3T3-E1小鼠前成骨细胞(华中科技大学同济医学院)培养在含10%胎牛血清(FBS)和1%青链霉素溶液(HyClone)的α-MEM (HyClone)细胞培养基中,并将其放入37 ℃恒温培养箱,每隔3天换一次培养基。
对于MTT试验,将培养好的细胞用培养基稀释到7×104 cells/cm3的浓度,取稀释的细胞液加入到含不同样品(Ti-OH(对照组),Ti-OH-PDA,Ti-OH-PDA-ZnO,Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC)的48孔培养板中,然后置于37 ℃恒温培养箱中培养3 d,取出孔板,用移液枪将细胞液吸出,然后每孔加入300 μL、5 μg/mL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液,继续放入37 ℃恒温培养箱培养4 h,目的是让MTT溶液与活细胞(活性酶)产生蓝紫色沉淀(吸附在钛片表面)。接着取出孔板,吸出溶液,向孔中继续加入300 μL二甲基亚砜(DMSO),振荡15 min,蓝紫色沉淀溶解,溶液变色,提取上清液,用酶标仪进行490 nm波长下的光密度测试,再转换成相应的细胞活性,每个测试用3个平行样进行统计学分析。样品中的细胞活性(%)=试验组OD值/对照组OD值×100%
另外,在第1天通过细胞染色检测细胞荧光。首先,用PBS洗涤细胞3次(pH=7.4),接着室温下用4%的甲醛溶液固定细胞10 min,PBS再次洗涤。然后用FITCPhalloidin(上海益森)在室温黑暗中染色30 min,再用40,6-二氨基吲哚二盐酸盐(DAPI)(上海益森)在黑暗中染色30 s。最后用荧光显微镜(IFM, Olympus, IX73)观察不同样品中的细胞形态。
1.2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性测试采用碱性磷酸酶(ALP)活性测试,研究MC3T3-E1前成骨细胞在钛片表面涂层上的成骨分化的能力,将MC3T3-E1细胞液(1.4×104 cells/cm3)加入到含不同样品(Ti-OH(对照组),Ti-OH-PDA,Ti-OH-PDA-ZnO,Ti-OH-PDA-ZnO @RGDC)的48孔培养板中,每孔加入300 μL,准备3个孔板,然后分别培养3,7,14 d,每隔3 d换一次培养基。规定时间培养后,吸出孔中液体,加入300 μL 1% Triton X-100。在37 ℃下放置1 h。然后根据AKP检测试剂盒(建成生物科技)的操作说明,在520 nm的微平板阅读器上测定ALP的活性。
2 试验结果与讨论 2.1 表面形貌及结构分析图1为ZnO QDs的XRD图谱,样品在2θ为31.7°,34.4°,36.3°,47.9°,56.6°,62.8°和68.0°的地方分别出现(100),(002),(101),(102),(110),(103)和(112)的特征衍射峰,所有衍射峰均与晶格常数a=0.325 nm,c=0.521 nm的纤锌矿晶体结构清晰对应,属于典型的纤锌矿结构ZnO[21-22]。
经XRD的物相分析确定其为纤锌矿结构ZnO后,运用TEM对其纳米尺度的形貌进行了观察,如图2所示,可以证实合成的是直径大约为10 nm的ZnO QDs。
图3为ZnO QDs以及ZnO@RGDC的红外图谱,从图3(a)可以看出,425 cm−1处的吸收峰为Zn-O键的振动吸收峰[13,15]。在图3(b)中,3400 cm−1处的吸收峰为RGDC中末端氨基N-H键的振动吸收峰,1080 cm−1处的吸收峰为RGDC中酰胺键的振动吸收峰[20],这两处峰的出现证实了RGDC成功的引入到了ZnO QDs表面。
图4和图5分别为钛片表面不同涂层的SEM形貌和EDS图谱,从图4中可以看出,与图4(a)中纯钛相比,图4(b)中碱热处理后的钛片表面有网状的疏松多孔结构,此种结构可使聚合物更易黏附在其表面,以供后续改性。从图5(a)可以看出,碱热钛片经过多巴胺浸泡后,其网状结构无明显变化,但从图5(d)中对应的EDS图谱可以看出,浸泡了多巴胺后的碱热钛片表面增加了N元素,这可说明碱热钛片表面聚多巴胺的形成。图5(b)(c)分别是Ti-OH-PDA-ZnO和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC表面的SEM形貌,从图5(b)中可以看出ZnO QDs附着在网状疏松多孔的钛片表面。从图5(c)中可以看出,浸泡RGDC修饰的ZnO QDs后,钛片表面出现一层绵密的涂层;从Ti-OH-PDA-ZnO和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC的EDS图谱5(e)(f)中可以看到均存在N元素和Zn元素,这说明ZnO QDs成功的结合到了钛片表面,而Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC中N元素的含量较Ti-OH-PDA-ZnO来说增加了,这说明RGDC修饰的ZnO QDs也成功的结合到了钛片表面。
图6为Ti-OH-PDA,Ti-OH-PDA-ZnO,Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC的XPS图谱,由图可以发现,a和b两组相较c组而言,增加了Zn与Mg元素,这是由于a和b两组中均含有掺镁的ZnO QDs,而a组较b组而言,其增加了S元素,这是因为a中有的RGDC是由C、H、O、N、S组成。
图7为Ti-OH-PDA-ZnO和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC的XPS图谱的C1s分峰,在图7(a)中,C1s有3个峰,分别是286.4 eV处的C−O键,285.4 eV处的C−C键和C−N键,284.6 eV处的C−H键,C−N键的存在说明多巴胺成功的黏附到钛片表面[23]。图7(b)中C1s有4个峰,分别为288.5 eV处的C=O键,286.4 eV处的C−O键和C−S键,285.4 eV处的C−C键和C−N键,284.6 eV处的C−H键,C=O键与C−S键的存在说明RGDC成功的连接到钛片表面[19.23]。
2.2 抗菌活性图8为样品组Ti-OH,Ti-OH-PDA,Ti-OH-PDA-ZnO,Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌的抗菌活性,由图可见,Ti-OH-PDA-ZnO与Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC对大肠杆菌具有高的抗菌效率,分别达到99.15%与98.95%。对于金黄色葡萄球菌,Ti-OH-PDA-ZnO对其抗菌效率也高达82.18%,但Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC的抗菌效率却只有24.06%。首先是因为涂层中存在ZnO QDs,在细菌代谢引起的酸性环境下,ZnO QDs会释放Zn2+,从而达到抗菌效果[13,23-26]。从抗菌效果来看,大肠杆菌对ZnO QDs更敏感。
为了进一步研究样品的抗菌性能,分别观测了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在各组样品表面的SEM形貌,如图9,可见大肠杆菌(第一排)和金黄色葡萄球菌(第二排)在Ti-OH,Ti-OH-PDA上的形态完好,但在Ti-OH-PDA-ZnO和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC上,形态明显被破坏,由此也可体现出样品的抗菌活性。
2.3 细胞毒性评价图10为MC3T3-E1小鼠前成骨细胞与不同样品(Ti-OH,Ti-OH-PDA,Ti-OH-PDA-ZnO,Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC)一起培养3 d和7 d后所测得的MTT结果,从图中可以看出,3天的MTT结果表明超过90%的细胞活性良好,且样品Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC上的细胞活性超过200%,这是由于RGDC多肽具有良好的生物相容性和细胞黏附性[18]。而在7 d的MTT结果中,样品Ti-OH-PDA-ZnO和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC上的细胞存活率有所下降,这是因为ZnO QDs中锌离子的释放对细胞生长有一定的破坏性[27-28]。
为了研究样品表面细胞生长状况,培养24 h后,通过F-actin/nuclei染色观察细胞荧光形态,IFM观察结果如图11所示。样品Ti-OH-PDA和Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC表面细胞均呈多边形扩张形态,成骨细胞触角伸展良好,细胞核数量变化不大,说明样品早期(24 h)具有良好的生物相容性。相较而言,样品Ti-OH-PDA-ZnO表面细胞形态多呈圆状,细胞核数量也少一点,其生物相容性明显不如Ti-OH-PDA-ZnO@RGDC。
2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性评价ALP活性是用来标记早期成骨细胞分化的最常用的方法之一。ALP是体内一种广泛存在的酶,其可在碱性环境下催化磷酸酯水解。小鼠成骨细胞与不同的样品共同培养14 d的分化情况可以用ALP量化做一个早期标记。图12为小鼠成骨细胞与不同样品共同培养后表现出来的ALP活性,从图中可以看出,ALP活性在3 d表现最高,第7天有所下降,到14 d又有所增加,这是因为PDA和RGDC良好的生物相容性和促细胞粘附性,从而表现出高的ALP活性[29]。而后由于ZnO QDs中锌离子的释放对细胞生长有一定的影响,从而导致ALP活性下降,但此种影响随着锌离子释放的量的减少而慢慢减小,所以到第14天,ALP活性又有所增加[23-26]。
3 结 论(1) EDS、XPS等结果表明,钛植入体表面实现了PDA (Polydopamine)/RGDC (Arginine-glycine-aspartic acid-cysteine)/氧化锌量子点(ZnO QDs)复合涂层的构建。
(2) 抗菌试验表明,PDA (Polydopamine)/RGDC(Arginine-glycine-aspartic acid-cysteine)/氧化锌量子点(ZnO QDs)复合涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的抗菌活性。
(3) 细胞毒性测试(MTT)和碱性磷酸酶(ALP)活性测试结果表明,PDA (Polydopamine)/RGDC(Arginine-glycine-aspartic acid-cysteine)/氧化锌量子点(ZnO QDs)复合涂层对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞具有良好的生物相容性以及促细胞粘附性。
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