钛及钛合金因其无毒、质轻、比强度高且杨氏模量与人体骨骼最为接近等优点,已逐渐成为人体硬组织修复与替换的首选医用金属材料[1-3]。但也存在诸多问题,比如钛本身不具备抗菌性能,植入后容易引起细菌感染;钛属于生物惰性材料,不易与骨组织形成生物性结合[4-5]。这些都会影响种植体的稳定性和成功率,进而增加病人的痛楚和经济负担,甚至危及病人的生命,同时也限制了其应用和发展。因此,如何改善钛及钛合金的抗菌性能和生物活性受到广泛关注。
植入物与人体组织、细胞及血液的相互作用发生在材料表面,因此国内外诸多学者先后采用不同的表面改性方法对钛及钛合金进行改性。李卫国等[6]利用溶胶-凝胶法在钛表面生成羟基磷灰石薄膜,有效促进骨结合和骨新生;Xie等[7]采用离子注入的方法将水和氢同时注入钛表面,改性后浸入模拟体液溶液中,其表面形成类骨的羟基磷灰石,有利于成骨细胞的黏附和生长;Ang Gao等[8]采用了磁控溅射和阳极氧化结合的方法成功制备出了银原位掺杂的TiO2纳米管阵列,提高了钛种植体的生物学性能。在诸多的表面处理方法中,微弧氧化方法具有工艺简单、适用范围广、节能环保等优点,形成的多孔TiO2涂层不仅具有较好的生物活性,且与基体材料冶金结合,不易剥脱,在医用金属表面改性方面具有很好的应用前景[9-11]。
锌和锶都是人体必需的微量元素,研究表明锌具有良好的抗菌性能,且可以维持机体正常生长发育、蛋白质代谢、膜稳定性[12-13]。锶能促进成骨细胞的增殖,增加碱性磷酸酶活性,促进新骨形成,还能够降低骨再吸收速率,加快植入体与宿主骨之间的生物结合[14-16]。利用微弧氧化技术制备含锌或者锶的多孔涂层,改善植入体生物活性已有相关研究,但同时具有锌锶两种元素的多孔涂层尚未见报道。因此,文中拟采用微弧氧化技术在纯钛表面制备锌锶共掺杂TiO2生物涂层,考察其抗菌效果及成骨细胞活性。
1 试验与方法 1.1 材 料试验材料为商业纯钛(99.99%,Φ 14 mm×2 mm),采用180、600和1 000号碳化硅砂纸逐级打磨,丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10 min后干燥备用。
1.2 涂层制备试样干燥后用AB胶密封,只留出1.53 cm2的表面。采用恒流模式,微弧氧化电源为直流脉冲电源,不锈钢板为阴极,试样为阳极,占空比30%,频率800 Hz。电解液由去离子水和醋酸钙(CA,C4H6O4Ca-H2O)、β-甘油磷酸钠(GP,C3H7Na2O6P-5H2O)、醋酸锌(ZA,Zn(CH3COO)2)、醋酸锶(SA,Sr(CH3COO)2)配制而成。对照组为纯钛微弧氧化组(M-Ti)、微弧氧化加锌组(M-Zn)和微弧氧化加锶组(M-Sr)。电解液成分及电源参数见表1。处理后的试样清洗干燥消毒后备用。
Samples | Electrolyte component / (mol·L−1) | I / A | Duration / min | |||
CA | GP | ZA | SA | |||
M-Ti | 0.1 | 0.02 | 0 | 0 | 0.2 | 5 |
M-Zn | 0.1 | 0.02 | 0.06 | 0 | 0.2 | 5 |
M-Sr | 0.1 | 0.02 | 0 | 0.05 | 0.2 | 5 |
M-Zn/Sr | 0.1 | 0.02 | 0.06 | 0.05 | 0.2 | 5 |
主要试剂如下:α-MEM(Gibco),Live/Dead Viahility/Cytot-oxicity Kit(Invitrogen),甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT),二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO),0.25%胰蛋白酶(Invitrogen),碱性磷酸酶缓冲液(Alkaline phos-phatase buffer solution,PBS)。紫外分光光度计(UV-1800PC),恒温培养箱,高压灭菌锅(LS-30),水浴恒温振荡器(WHY-2),酶标仪(Infinite F50,TECAN),激光共聚焦扫描显微镜(C2 Plus)。
1.4 涂层表面形貌及成分分析采用带FALCON60S能谱分析仪(EDAX)的JSM-6360LV型扫描电子显微镜(SEM)观察涂层表面形貌及元素组成。采用D/Max2700型X射线衍射仪(XRD)测定涂层表面物相结构,选用铜靶,X射线波长λ=1.540 6 Å,扫描角度2θ为20°~80°,扫描速度为0.02°/s。
1.5 抗菌性能试验采用平板培养法评价涂层的抗菌性能,所用菌种为大肠杆菌。将试验所用大肠杆菌接种到灭菌后的液体培养基中,在37 ℃、70 r/min的水浴振荡器中过夜培养。用分光光度计测量菌液浓度,PBS稀释至菌液浓度为104 cfu/mL,将50 μL菌液均匀滴到置于24孔板中的试样表面。在37 ℃的恒温培养箱中培养24 h后,将试样表面菌液梯度稀释后,各取50 μL的稀释菌液滴到含有固体培养基的培养皿中,均匀涂开,将培养皿放在37 ℃的恒温培养箱中培养,观察菌落数量,并用如下公式计算试样的抗菌率:
其中,B为各组试样表面的活细菌数,A为对照组即M-Ti试样表面的活细菌数。
1.6 小鼠成骨细胞复苏取出冻存的MC3T3-E1细胞迅速置于37 ℃水浴中并不断搅动,使冻存物在1 min内完全融化,把细胞悬液吸到离心管中离心(1 000 r/min,10 min),弃上清液,加入适量细胞培养基,在5% CO2、95%湿度、37 ℃下恒温培养,隔天换液,继续培养。
1.7 细胞荧光染色将试样放入24孔板中,细胞接种密度2×104 个/孔。培养3 d后,吸弃培养基,PBS缓慢漂洗3次。每个试样表面滴加Live/Dead染色剂50 μL,在37 ℃恒温培养箱培养1 h后,用激光共聚焦扫描显微镜拍摄试样表面细胞密度。
1.8 细胞增殖特性测定细胞接种密度及培养方法同上,细胞培养3 d后,每孔加入100 μL MTT溶液,继续培养4 h后终止培养,弃去培养液,PBS漂洗3次。加入DMSO 1 000 μL/孔,振荡10 min使结晶物充分溶解,从每孔中吸出100 μL上清液转移至96孔培养板中,用酶联免疫检测仪(λ=492 nm)测定吸光度值。
2 结果与结论 2.1 涂层的形貌微弧氧化制备的TiO2涂层表面形貌如图1所示。所有涂层表面均为多孔结构,微孔分布均匀,孔径大小在2~5 μm之间,表明电解液中锌和锶的掺入对微弧氧化形成的涂层表面形貌没有显著影响。大量研究表明,这种粗糙多孔的表面结构有利于成骨细胞粘附和增殖,促进骨组织生长,改善种植体与骨组织的结合[17]。
图2为M-Zn/Sr组涂层表面选区EDS及Mappings图。从图中可以看出:电解液中的钙、磷、锌、锶元素成功掺入到微弧氧化涂层中,且均匀分布在涂层表面。各涂层中元素成分及含量见表2,可以看出随着锌、锶的掺入,涂层中钙、磷元素含量增加,研究表明钙磷有利于涂层中羟基磷灰石的形成,进而提高涂层生物活性[18]。
(a/%) | ||||||
Samples | O | Ti | Ca | P | Zn | Sr |
M-Ti | 70.51 | 24.18 | 2.21 | 3.10 | ||
M-Zn | 69.48 | 16.53 | 3.24 | 4.22 | 6.52 | |
M-Sr | 66.7 | 20.3 | 6.2 | 4.7 | 2.1 | |
M-Zn/Sr | 64.4 | 15.6 | 4.4 | 5.9 | 7.9 | 1.7 |
图3为涂层截面形貌及截面上各元素分布。由图可知:涂层厚度在10~20 μm之间,M-Zn及M-Sr组分别检测出锌、锶元素的存在,在M-Zn/Sr涂层中可以观察到锌、锶两种元素的分布,各元素在截面中均匀分布,结合涂层表面EDS结果可知,钙、磷、氧、锌、锶等元素在相应涂层中分布均匀。
2.2 涂层表面物相图4为各涂层表面XRD物相分析结果。从图中可以看出:微弧氧化后的涂层表面主要由金红石型TiO2、锐钛矿型TiO2和纯钛相组成。M-Zn、M-Sr及M-Zn/Sr试样表面均未检测出含锌或含锶化合物的衍射峰,这可能与锌和锶的掺入量较少或在物相中均匀分布有关。此外,随着电解液中锌和锶的掺入,样品表面图谱衍射峰半峰宽及对应衍射角没有发生变化,说明电解液中锌和锶的掺入对涂层表面物相组成的影响不大。
2.3 涂层的抗菌性能图5为M-Zn/Sr组和对照组与大肠杆菌作用24 h后用PBS按10、100、1 000倍梯度稀释后的抗菌效果图。图中白色斑点代表菌落,可以看出M-Ti及M-Sr与细菌作用24 h后表面仍有大量菌落,M-Zn和M-Zn/Sr试样表面存活菌落较少。图6为培养24 h后各涂层对大肠杆菌的抗菌率。M-Zn和M-Zn/Sr组试样对大肠杆菌的抗菌率均接近100%,M-Sr组抗菌率较低,接近60%。说明涂层中锶元素的掺入对大肠杆菌的抑制作用较小。M-Zn和M-Zn/Sr涂层对大肠杆菌具有良好的抗菌效果。
细菌在植入材料表面的粘附、增殖并形成细菌生物膜是引发植入体感染的主要原因。涂层中释放的带正电荷的锌离子可吸附在细菌细胞膜上,进而穿透细胞壁进入细菌体内,与其中的功能团发生反应,破坏细菌酶活性,使其丧失分裂增殖能力而死亡,从而可以达到抑菌目的,锌含量越高抗菌效果越好[19]。
2.4 细胞相容性采用Live/Dead荧光染色试剂盒对在试样表面培养了3 d的成骨细胞进行荧光染色,探究涂层的细胞毒性。该试剂盒含有钙黄绿素-AM (Calcein-AM)和溴乙啡锭二聚体(EthD-1)。Calcein-AM能够穿透活细胞膜,对活细胞进行染色,使其发出强绿色荧光,EthD-1只能进入质膜受损的细胞并与DNA结合发出红色荧光。染色结果如图7所示,由图中可以看出各组试样表面均能观察到绿色荧光,细胞完整性未受到破坏,细胞铺展良好,有明显的丝状伪足扩张趋势。图7(c)(d)中个别红色荧光(箭头所示)为培养过程中正常死亡现象。对比图7(a)可以发现,随着涂层中锌和锶的加入,活细胞数量增多,M-Zn/Sr组表面活细胞数量最多。说明4组试样表面对成骨细胞均无细胞毒性,成骨细胞在涂层表面附着良好,锌和锶的加入能促进涂层表面成骨细胞增殖[20-21]。
细胞接种到试样表面培养1 d和3 d天后利用MTT的方法定量分析各涂层对成骨细胞增殖的作用。MTT能与活细胞线粒体中的脱氢酶发生反应生成甲瓒,DMSO溶解甲瓒后通过测试吸光度值来反映活细胞的数量。MTT测试结果如图8所示,培养1 d后与M-Ti组试样相比,M-Zn、M-Sr和M-Zn/Sr试样表面的吸光度值均有所增加,但M-Zn、M-Sr和M-Zn/Sr数值差别不大。培养3 d后4组试样吸光度值均明显提升,且与M-Ti相比试验组增殖效果较为明显,M-Sr高于M-Zn,M-Zn/Sr吸光度最大。与荧光染色结果相对应。
结合成骨细胞荧光染色和MTT增殖结果可知,成骨细胞在M-Zn/Sr涂层表面增殖效果较好,并且锌和锶的掺入对成骨细胞增殖都具有良好的促进作用,锶对细胞的增殖效果更为明显。研究表明,涂层中释放的锌离子和锶离子,均能刺激细胞发育能力,增强ERK1/2信号,从而促进细胞增殖和分化[22]。此外,适当浓度的锶离子(低于10%)还可以激活Wnt/b系列蛋白信号,促进成骨细胞成核因子,抑制破骨细胞分化因子,进一步促进成骨细胞增殖分化[23]。
3 结 论采用微弧氧化技术在纯钛表面成功制备出锌锶共掺杂的TiO2多孔涂层。结果表明:
(1) TiO2涂层表面微孔分布均匀,孔径大小在2~5 μm之间,涂层与基体结合良好,主要由金红石相和锐钛矿相组成。锌锶共掺杂TiO2涂层表面锌、锶的原子数分数分别为7.9%和1.7%,涂层厚度为10~20 μm,各元素在涂层中分布均匀。
(2) 锌及锌锶共掺杂TiO2涂层对大肠杆菌显示出较强的杀菌作用,抗菌率接近100%。
(3) 细胞试验证实,涂层中锌和锶的掺入能够促进TiO2涂层表面成骨细胞粘附和增殖,其中锌锶共掺杂涂层对成骨细胞的增殖作用最为明显。
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