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镁含量丰富，被誉为“21世纪最具前途及发展潜力的绿色工程材料”，是人体代谢必须的矿物元素，其化学性质极其活泼，植入体内后通过化学腐蚀溶解，可短时间降解，吸收或排出体外[1]。镁的密度为1.74~2.0 g/cm3，与人体自然骨密度(1.8~2.1 g/cm3)相似，具有适当的强度和良好的生物相容性，有利于骨再生[1-2]，是最有希望应用于临床的可降解骨内固定材料。但目前医用纯镁材料尚未得到临床应用，其原因是早期的临床实践发现，镁在体内降解速度过快，产生的氢气使周围环境碱化而引起溶血等一系列生物学问题[2-3]。因此，研究者们通过对纯镁表面进行处理，以期提高其耐腐蚀性。
在纯镁的表面处理方法中，微弧氧化方法是近年来的研究热点。传统微弧氧化工艺(Micro-arc oxidation，MAO)是通过电解液与相应电参数组合，在金属表面原位生长出陶瓷膜层，使其耐腐蚀性得到提高[4-5]。但纯镁MAO膜层中存在贯穿的微孔和微裂纹，会成为体液侵入基体的通道，产生点蚀或缝蚀，降低镁植入材料的使用寿命，影响骨组织修复。因此，对纯镁MAO膜层后处理很有必要。植酸(C6H18O24P6)，化学名称为环己六醇六磷酸酯，是一种从粮食作物中提取出来的金属多齿螯合剂[6-7]。利用它与金属反应形成的金属螯合物稳定性强，可以使膜层均匀致密，能够较好地防护金属。作者课题组[8]研究制备出纯镁超声微弧氧化(Ultrasonic micro-arc oxidation，UMAO)-植酸转化膜，这种膜层的致密性大大提高、稳定性极强，耐腐蚀性能较优，使纯镁在体内的降解速度得到控制。
另外，在临床实际操作中由植入体引发的感染导致手术失败，仍存在很高发病率，长期困扰着医务人员。研究表明引起感染的主要致病菌为金黄色葡萄菌[9-10]。为此，能否将纯镁UMAO-植酸膜层载入某些金属离子构成复合膜层使其具有抗菌性，成为了研究重点。银、锌等金属元素作为无机抗菌剂已经得到了广泛的研究和应用[11]。其中锌(Zn)是人体中的微量元素，在各种生理活动中发挥着重要作用，且锌易附载于材料表面，能够有效地杀死多种细菌。
为了赋予纯镁UMAO-植酸膜层抗菌性和生物活性，首次引入锌作为抗菌离子，通过超声微弧氧化、植酸转化、化学镀3种表面技术复合，形成一种方法简便的纯镁表面复合膜层制备工艺。其中纯镁UMAO-植酸转化膜工艺已进行前期研究，结果表明：经过植酸处理后的膜层表面更加致密，耐蚀性得到提高。文中在纯镁UMAO-植酸转化膜工艺的基础上，研究化学镀锌对膜层的组织形貌及抗菌性的影响，期望通过化学镀锌的方法得到既能调控降解速度又具有抗菌性和生物活性的多功能可降解医用镁骨内固定材料，为医用纯镁材料早日实现临床应用提供理论基础。
1 试验与方法 1.1 材料与试剂试验材料为纯镁(质量分数为99.90%)，尺寸为15 mm×15 mm×1.0 mm。材料表面经800、1 500和2 000号砂纸打磨，用95%的无水乙醇超声清洗20 min，然后在H3PO4溶液(100 g/L)→蒸馏水→NaHCO3溶液(80 g/L)→蒸馏水中依次清洗30 s，自然晾干后备用。
试验菌株选用大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.colis) ATCC 25922和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus) ATCC 6538两种。
1.2 膜层制备方法及分组微弧氧化处理采用复合脉冲微弧氧化电源设备，在恒电压下制备微弧氧化多孔陶瓷层，电压300 V，频率500 Hz，时间10 min，占空比2.5%。电解液采用Na2SiO3·9H2O、KOH和KF为主要成分的磷酸盐体系。用纯镁片作阳极，不锈钢镀槽为阴极。膜层制备在超声环境下进行，超声功率60 W，频率40 kHz。
植酸转化膜溶液采用50%的植酸，添加少量H3BO3和NaF超声混匀，用NaOH溶液调节pH至7~8；将UMAO处理试样置于40 ℃的植酸转化膜溶液中，浸泡10 min，取出晾干。化学镀锌溶液以醋酸锌为主盐，焦磷酸钠为还原剂，在50 ℃下浸镀UMAO-植酸处理后试样，时间分别为1、3和5 min。
UMAO试样为对照组，UMAO-植酸处理试样、UMAO-植酸-镀锌试样为试验组；分别表示为UMAO、UMAO-植酸、UMAO-植酸-Zn 1 min、UMAO-植酸-Zn 3 min和UMAO-植酸-Zn 5 min。
1.3 测试与分析 1.3.1 复合膜层相分析及表面形貌所用设备为德国Bruker D8 ADVANCE XRD射线衍射仪(XRD)，测试参数为：铜靶Kα辐射，石墨单色器滤波，特征波长为0.541 8 nm，加速电压40 kV，管电流40 mA，发散狭缝发射角DS为1°、防散射狭缝发射角SS为1°、接收狭缝RS为0.15 mm，扫描角度30°~90°，步长10°/min，X射线衍射谱利用JCPDS标准卡标定。
使用带FALCON60S能谱分析仪(EDAX)的JSM-6360LV型扫描电子显微镜(SEM)分析观察膜层的表面形貌与元素分布。
1.3.2 抗菌试验菌株培养按照国家标准GB/T 4789.2-2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》方法。用营养肉汤复苏大肠埃杆菌和金黄色葡萄球菌冻干株，分别接种于营养琼脂培养基上，在(36±1) ℃，相对湿度RH > 90%条件下培养24 h；在24 h内连续转接2次后，用接种环从上述培养基中取少量新鲜细菌，加入营养肉汤(含少量无菌表面活性剂)培养液中，依次制备10倍系列稀释液，培养24 h，记录稀释倍数和相应菌落数量(Colony formoing units，CFU)，选取菌液数量为30~300 CFU的相应稀释液作为试验菌液。
覆膜法抗菌效能检测，每组选取3个平行试样，将消毒后的各组试样置于直径90 mm的玻璃培养皿中央，用移液枪吸取100 μL试验菌液分别滴加在各组试样表面，使菌液均匀接触试样散开，勿使菌液溢出，覆盖无菌的PE膜。培养24 h后取出试样，加入20 mL的洗脱液反复冲洗，充分混合后取100 μL洗脱液接种于营养琼脂培养基上，均匀推开，在(36±1) ℃下培养24 h，进行平板菌落计数。以上试验重复3次，根据统计各组菌落的总数，计算各组试样的抗菌率，抗菌率计算公式为：
其中，R为抗细菌率，%；B为对照组试样平均回收菌落数，CFU/mL；C为试验组试样平均回收菌落数，CFU/mL。参照QB/T2591-2003《中华人民共和国轻工业标准-抗菌塑料抗菌性能试验方法和抗菌效果》，抗菌率R≥90%的试样，有抗菌作用；抗菌率R≥99%的试样，有强抗菌作用。
2 结果与讨论 2.1 复合膜层的相结构图 1是纯镁UMAO、UMAO-植酸及UMAO-植酸-镀锌膜层的XRD衍射图谱。3组试样主要由Mg和MgO相组成。图 1(a)(b)中均有基体Mg的衍射峰产生，是由于膜层较薄，X射线穿透膜层达到基体，使Mg发生衍射；镁基体在超声微弧氧化过程中与电解液中的氧发生反应生成MgO，产生MgO衍射峰。UMAO-植酸-镀锌组(图 1(b))的相分析中，由于化学镀锌时间短，膜层含Zn元素较少，因此图谱中没有出现Zn的衍射峰。
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| 图 1 不同镀锌时间处理前后膜层表面的相组成 Figure 1 XRD patterns of the films surface with different galvanizing time before and after treatment |
不同方法处理后膜层的表面形貌见图 2。纯镁UMAO膜层(图 2(a))表面分布着孔径大小不等的微孔和微裂纹，这些微孔和微裂纹是体液直达基体的通道，会引起Mg基体的腐蚀。
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| 图 2 不同镀锌时间处理前后膜层的表面形貌 Figure 2 Surface morphologies of the films with different galvanizing time before and after treatment |
经植酸转化膜处理后(图 2(b))微孔孔径变小，微裂纹消失。这是由于植酸分子有较强的螯合能力，植酸在水中电离带负电荷，金属易失电子带正电荷，植酸分子每个磷酸基中的O原子均可作为配位原子和Mg2+离子发生络合[8]。因此，膜层中的微孔被植酸金属螯合物覆盖，体现了植酸的封孔作用。
图 2(c)(d)(e)中，UMAO-植酸-镀Zn组膜层表面已无大孔隙，细小微孔也均被覆盖，无裂纹产生，膜层的表面出现白色颗粒附着。在化学镀锌过程中，植酸螯合锌离子进行化学吸附，形成含锌元素的金属螯合层，进一步起到封孔作用。随着镀锌时间增加，膜层表面的微孔越来越小，膜层表面越来越致密均匀。
2.3 复合膜层的表面元素纯镁UMAO、UMAO-植酸及UMAO-植酸-镀锌膜层的元素平均成分分析见图 3。膜层由基体镁和镀液成分构成，3组试样膜层主要成分为Mg、O、C、Si，并含有少量Na、F、K，其中Mg和O的含量最高，这与XRD相分析中出现Mg和MgO的衍射峰结果一致。
纯镁UMAO膜层经植酸处理后(图 3(b))其成分增加了B和P元素。其成膜过程是植酸中的磷酸基与UMAO表面孔隙及膜层中的Mg发生了金属络合反应生成金属螯合物，使膜层表面富含PO43-和OH-，可以保护纯镁基体[8]。植酸作为偶联剂，联接基体镁反应式如下：
这种金属螯合物化学性质稳定，既可以起到封孔作用(图 2(b))，还可以显著提高膜层的耐腐蚀性。进一步验证了植酸的引入控制了镁离子释放，减缓了镁的降解，保证了纯镁在骨植入手术后充分行使其生物力学功能。
在此基础上，引入锌元素作为抗菌剂[12-14]，化学镀锌后，发现镀锌时间不同会影响镀锌量。镀锌1 min时Zn元素含量(质量分数)为0.49%(图 3(c))，镀锌3 min时Zn元素含量为0.80%(图 3(d))，镀锌5 min时Zn元素含量为1.50%(图 3(e))；随着镀锌时间增加，试样表面的锌含量增多；UMAO-植酸-Zn 5 min组镀锌时间长，锌量最多。这是由于化学镀锌时，镀锌镀液中的锌元素以锌离子存在，UMAO-植酸膜层表面的C6H18O24P6与锌离子发生反应，形成含金属锌的螯合物C6H16O24P6Zn，吸附于膜层表面。
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| 图 3 不同镀锌时间处理前后膜层表面的能谱分析 Figure 3 EDS of the films surface with different galvanizing time before and after treatment |
另外，微弧氧化膜层存在微孔，毛细作用使镀锌液浸入实现了封孔。随镀锌时间的增加，锌含量增加，膜层表面越来越致密均匀，此结果与SEM分析结果相吻合。
2.4 复合膜层的抗菌性能表 1为纯镁经不同表面处理后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌结果。图 4为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在各组试样表面培养24 h后菌落的生长情况。与UMAO对照组(图 4(E-a)(S-a))相比，UMAO-植酸组(图 4(E-b)(S-b))中菌落数量略有减少，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中抗菌率分别为39.4%和29.4%；镀锌1 min时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种培养皿中的菌群数量减少一半(图 4(E-c)(S-c))，抗菌率明显提高到46%和74%；镀锌3 min膜层，对大肠杆菌的抗菌率超过90%，说明该膜层具有抗菌作用，金黄色葡萄球菌的抗菌率达到87%，接近国标抗菌性能规定标准≥90%，膜层具有抗菌性；镀锌5 min膜层接触培养后菌落所剩无几(图 4(E-e)(S-e))，抗菌率高达99%，达到行业标准中强抗菌作用标准，膜层具有强抗菌功能，抗菌性能最好。
| (%) | ||
| Group | E.coli | S.aureus |
| UMAO | ||
| UMAO-Phytic acid | 39.4 | 29.4 |
| UMAO-Phytic acid-Zn 1 min | 46.2 | 73.6 |
| UMAO-Phytic acid-Zn 3 min | 96.2 | 86.5 |
| UMAO-Phytic acid-Zn 5 min | 98.6 | 99.1 |
|
| 图 4 不同膜层表面E.coli和S.aureus 24 h的菌落情况(E：大肠杆菌；S：金黄色葡萄球菌) Figure 4 Growth of the E.coli and S.aureus on the different films for 24 h (E: E.colis; S: S.aureus) |
抗菌结果表明：抗菌程度与镀锌量有关。通过化学镀锌法处理后的复合膜层，随着膜层表面Zn含量的增加，膜层的抗菌性能随之增强，有效地抑制了细菌的繁殖生长，表现出了极强的杀菌作用。其抗菌机理符合接触机制[15-16]。菌液接种在不同纯镁试样表面，当细菌与UMAO-植酸-镀锌膜层上的锌离子直接接触时，锌离子带正电荷与细菌细胞膜表面负电荷相互吸引，并从膜层上释放，突破细菌细胞膜，进而破坏细菌的生存和繁殖能力。当菌体被杀灭后，锌离子又借助液体培养基游离，与其他细菌继续进行接触反应，继而形成微动力效应。UMAO-植酸-Zn 5 min组锌含量最多，锌离子参与接触反应最充分，提高了杀菌速率，杀菌效果最好。无论是对金黄色葡萄球菌还是大肠杆菌，抗菌率均达99%，达到了预期的效果。因此，该组材料表现的抗菌作用最强。
3 结论(1) 纯镁超声微弧氧化-植酸处理膜层通过化学镀锌形成复合膜层提高了纯镁的耐腐蚀性，并且赋予其抗菌性能。
(2) 随化学镀锌时间增加，膜层表面孔隙减少、愈加致密，试样表面的Zn含量呈增多趋势。
(3) 镀锌含量对膜层的抗菌性能有直接影响，其抗菌性能随锌含量的增加而增强，镀锌5 min时，膜层锌含量达1.5%，抗菌率高达99%，具有强抗菌功能。
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