BAI Y, LIU Q b, XU P, et al . Effects of Rare Earth Content on Microstructure and Cell Compatibility of Ca-P Ceramic Coating Fabricated by Laser Cladding. China Surface Engineering, 2016, 29(5): 66-71.
2. 贵州大学 贵州省材料结构与强度重点实验室, 贵阳 550025
2. Key Laboratory for Material Structure and Strength of Guizhou Province, Guizhou University, Guiyang 550025
激光熔覆技术具有快速熔凝、高能量密度和高强度等独特优势[1-2]，在理论和实际应用中都取得了极大的发展。羟基磷灰石(HA)是人体骨骼组织主要的无机成分，具有极佳的生物活性和生物相容性。β-TCP是优良的生物活性降解材料，在近代医学工程学领域中倍受人们的关注。将含有HA和β-TCP的生物活性陶瓷[3-4]熔覆在力学性能优良的医用钛合金上，可以克服陶瓷易脆和强度低等缺点，制备出既具有良好的生物活性、又具有优秀综合力学性能的生物陶瓷涂层[5-6]。刘其斌课题组[7-8]采用梯度设计思想，避免了基材与涂层之间因膨胀系数差异大而带来的不良影响，实现了基材与陶瓷层之间良好的冶金结合，增强了涂层之间的结合强度。目前，国内外的研究热点主要集中在生物陶瓷涂层的制备方法及其生物活性的考察，但是对改善生物陶瓷涂层性能方面研究较少。应用陶瓷领域发现稀土能够起到净化晶界、细化晶粒、改善组织结构等作用。并且稀土具有无毒，抗菌，诱导或抑制细胞因子的表达，催化合成物相组成等优异性能[9-12]。因此研究稀土氧化物对Ca-P陶瓷涂层组织结构及细胞相容性的影响具有重要的医学应用研究价值。
1 试验 1.1 试验材料基材为加工成50 mm×30 mm×5 mm的长方体医用钛合金(Ti6Al4V)，熔覆粉末为分析纯CaHPO4·2H2O、CaCO3和稀土氧化物La2O3以及Ti粉。细胞系：MG63，DMEM培养基，荧光素乙酰乙酸盐(FDA)，PBS缓冲液，胰酶，标准小牛血清(FBS)，二甲基亚砜(DMSO)。
1.2 试验方法文中采用TFL-H10000型10 KW横流CO2激光器。理论上HA的钙磷原子比为1.67，但在激光熔覆过程中Ca与P都存在损烧，尤其是P的损烧更为严重，故取Ca/P=1.4进行设计。并且对熔覆层进行梯度成分设计[13](见表 1 )，以改善涂层与基体的结合强度。
| Combined powders / % | 81.12%CaHPO4·2H2O+18.88%CaCO3+x%La2O3 | Ti powders |
| Gradient layer 1 | 30 | 70 |
| Gradient layer 2 | 70 | 30 |
| Gradient layer 3 | 100 | 0 |
| (Note: x is 0,0.2,0.4,0.6,0.8) | ||
用金相砂纸打磨基材去除其表层的氧化皮，用石油醚丙酮酒精蒸馏水依次清洗洗净，采用预置涂层法将第一层梯度涂层粉末涂覆在钛合金表面上，涂覆厚度为0.5 mm左右。先熔覆第一梯度层，用钢刷和酒精清理表面后再熔覆第二梯度层，同样的清理方法再熔覆第三梯度层，从而在钛合金上制备出Ca-P陶瓷涂层。优选的激光熔覆工艺参数为输出功率P=1.8 kW，扫描速度V=240 mm/min，光斑直径D=4 mm。将试样线切割成10 mm×10 mm×3 mm小试样，用石油醚丙酮酒精蒸馏水依次清洗洗净，放入干燥箱中待用。一共有5组样品，La2O3的质量分数分别为0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%。使用OLYMPUS GX51型金相显微镜对试样截面进行金相组织分析。采用D/Max-2200型X衍射测试仪分析涂层物相。
1.3 模拟体液(SBF)浸泡试验将含有不同La2O3含量梯度陶瓷涂层浸泡在不同的离心管中14 d，放入37 ℃恒温箱中并且每天换一次新鲜的SBF溶液。SBF溶液配制方法和Tadashi K和Hiroaki T的相同[14]。采用SUPRA-40型扫描电镜对浸泡14 d后的涂层进行组织形貌观察。
1.4 MTT法和荧光显微观察将洁净的试样从干燥箱中取出，放入金属饭盒高温灭菌后使用。一共设置5组试验(稀土含量为0%的为对照组，其余的为试验组)，每组3个平行样。将试样放入24孔板里，每孔加入1mL含有细胞的培养基，细胞密度为1×104个/mL，设置2，4和6 d这3个时间点。每2 d换一次培养基。使用荧光装置(OlympusBH2-RFL-T3)，成像装置(Olympus600CL)对用FDA染色后的细胞进行数量和生长形态的观察。使用酶联免疫检测仪(THERMO varioskan flash)测量不同试验组的光密度(OD,optical density)值。
2 结果与讨论 2.1 Ca-P陶瓷涂层横截面形貌分析激光熔覆Ca-P陶瓷涂层横截面形貌如图 1 所示，激光熔覆后的Ca-P陶瓷涂层横截面可分为基材，合金化层和陶瓷层3个区域。与无稀土含量的陶瓷涂层相比，添加稀土氧化物La2O3的Ca-P陶瓷涂层裂纹和孔洞较少，涂层之间结合紧密，结合强度高。纵向微小裂纹和小孔洞的存在可以为骨细胞提供生长通道，使陶瓷涂层与原骨组织形成牢固的生物键合[15]。合金化层也将作为一道有效的屏障阻碍Al、V等有害离子游离到人体组织，对人体起到保护作用。
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| 图 1 不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层的截面形貌 Figure 1 Cross section morphologies of Ca-P ceramic coatings with different content of La2O3 |
图 2 给出了不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层X射线衍射图谱。从图中可以看出，经过激光熔覆的梯度活性陶瓷涂层主要含有HA、β-TCP、TiO2、CaTiO3等物相。在2θ为32~33°附近，当La2O3添加的质量分数为0.6%时，其XRD图谱中β-TCP+HA的衍射特征峰最高，表明其生成β-TCP+HA的量最多，具有最多的生物活性相。当稀土含量(质量分数)达到0.8%时，β-TCP+HA的特征峰反而降低，可见稀土的催化作用具有二面性。其原因应该是稀土元素都是活泼金属，从电子结构看，d5轨道是空的，提供了良好的电子转移轨道，可作为催化作用的“电子转移站”，因此稀土元素及其化合物具有较高催化活性。稀土元素能与元素周期表中几乎所有金属元素形成金属间化合物。添加少量稀土氧化物La2O3能与氧、钙和钛等元素发生化学反应生成高熔点化合物，一些化合物可以作为形核核心，增加了β-TCP和HA的形核率。但是当稀土质量分数达到0.8%时，离子浓度过高会在晶界富集，降低晶界表面能，减小晶粒长大的推动力，从而阻碍了β-TCP和HA生成，特征峰反而降低。
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| 图 2 不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层XRD图谱 Figure 2 XRD patterns of Ca-P ceramic coatings with different content of La2O3 |
综上所述，当稀土氧化物La2O3添加质量分数为0.6%时，经过激光熔覆后的Ca-P陶瓷涂层中会生成最多生物活性陶瓷，活性较佳。
2.3 Ca-P陶瓷涂层在模拟体液浸泡14 d后的表面形貌观察及分析大多数科研人员常根据生物材料表面能否形成类骨磷灰石，以及根据其表面上类骨磷灰石的形成速度和数量来判断其生物活性，体外模拟体液(SBF)浸泡试验是最常用最简单有效的方法，是考察生物材料是否具备生物活性的主要依据之一。
图 3 给出了在Ca/P=1.4的情况下不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层在SBF中浸泡14天后的微观表面形貌。涂层表面上出现了肉眼可见的白色沉积物，对白色沉积物进行了EDS能谱分析，由图 3(f)可知，Ca与P的原子比约为1.67，与类骨磷灰石的Ca与P的原子比值基本一致，表明生成的物质为类骨磷灰石[16]。并且稀土氧化物含量对生物陶瓷涂层的裂纹敏感性有一定影响[17]。从图中对比可以发现，当稀土氧化物La2O3的质量分数为0%的时候，Ca-P陶瓷涂层表面有明显的裂纹存在，并且表面上类骨磷灰石数量较少。图 3(b)~(e)表明稀土氧化物La2O3的加入能够降低裂纹敏感性，涂层稳定性进一步提高，并且有利于类骨磷灰石的沉积，表明其生物活性较好。当稀土氧化物添加量(质量分数)为0.2%~0.6%时，涂层表面上白色沉积物数量明显增多，当涂层中La2O3添加量为0.6%时，涂层表面上类骨磷灰石数量最多，分布最广，表明其生物活性最佳。当稀土氧化物La2O3添加含量为0.8%时，表面类骨磷灰石数量明显减少。
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| 图 3 不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层在模拟体液中浸泡14天后的形貌及白色区域能谱 Figure 3 Morphologies of Ca-P ceramic coatings with different content of La2O3 immersed in SBF for 14 days and EDS of the white area |
图 4 为成骨细胞MG63在不同组激光熔覆Ca-P陶瓷涂层上培养2、4和6 d这3个时间点后，采用MTT[18]比色法测定的3个时间点光密度值(OD值)。由图可见，随着培养时间的延长，细胞增殖稳定，添加稀土氧化物的Ca-P陶瓷涂层比未加入稀土的涂层生物活性要好，也表明了激光熔覆Ca-P陶瓷涂层无毒无害并且具有较好的细胞相容性。从2、4和6 d这3个时间点来看，当稀土氧化物La2O3质量分数为0.4%~0.6%时，OD值最高，表明涂层上细胞相对数量最多，活力度最大，最适合细胞的稳定增殖与生长。这可能是与其催化合成生物活性相HA+TCP数量多有关。
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| 图 4 MG63在不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层表面增殖结果 Figure 4 Proliferation of MG63 on the surface of Ca-P ceramic coatings with different content of La2O3 |
图 5 为不同含量La2O3的Ca-P陶瓷涂层与成骨细胞共培养4天的荧光染色结果，由FDA染色。因为FDA只能染活细胞，呈现绿色，所以Ca-P陶瓷涂层上细胞数目多少可以间接反映出稀土含量不同陶瓷涂层的生物活性。涂层上没有细胞铺展的地方表明其表面上有大量的死细胞，从而不能被染成绿色，也就不能在图片上显示出来。由图 5(a)~(e)可见，成骨细胞MG63在Ca-P陶瓷涂层上生长状况良好且很好地铺展开来，细胞形态都较好。也证明了梯度稀土活性陶瓷涂层能够很好的为成骨细胞所接受，实现了良好的生物相容性，适合细胞的生长。当稀土氧化物La2O3质量分数为0.4%~0.6%时，成骨细胞在其表面上数目最多生长形态也较好，说明稀土氧化物La2O3质量分数为0.4%~0.6%的涂层细胞相容性最佳。
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| 图 5 不同La2O3含量Ca-P陶瓷涂层表面细胞生长形态 Figure 5 Cell growth morphologies of Ca-P ceramic coatings with different content of La2O3 |
(1) 与无稀土的陶瓷涂层相比，添加稀土氧化物La2O3的Ca-P陶瓷涂层裂纹，孔洞较少，涂层之间结合紧密，结合强度高。
(2) 激光熔覆Ca-P陶瓷涂层主要物相含有HA、β-TCP、TiO2、CaTiO3等。当稀土氧化物La2O3的质量分数为0.6%，催化合成的HA+β-TCP的量最多，具有最佳的生物活性相。
(3) 当涂层中La2O3质量分数为0.6%时，涂层表面上类骨磷灰石数量最多，分布最广，表明其生物活性最佳。当稀土氧化物La2O3质量分数量为0.8%时，表面类骨磷灰石数量明显减少。
(4) 细胞实验表明Ca-P陶瓷涂层无毒无害，MTT法和荧光显微分析可知当稀土氧化物La2O3质量分数为0.4%~0.6%时，涂层具有最佳的细胞相容性和生物活性，适合细胞的稳定增殖与生长。
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